DNA测序技术

长期以来，DNA测序技术一直是分子生物学相关研究中最常用的技术手段之一，从一定程度上推动了该领域的快速发展。人类基因组计划、转录组分析、微生物基因组重测序、单核苷酸的多态性 (single nucleotide polymorphisms,SNP) 分析等方面也促进了其他生物学领域的研究和发展。每一代测序技术的更替都标志着生物学中基因芯片、数据分析、表面化学、生物工程等技术领域有了新的突破，从而应用在了测序领域，大大降低了测序成本，提高了测序效率，使测序向着高通量、低成本、高安全性和商业化的方向发展。

第二代测序（Next-generation sequencing，NGS）又称为高通量测序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。我们都知道一代测序为合成终止测序，而二代测序开创性的引入了可逆终止末端，从而实现边合成边测序（Sequencing by Synthesis）。二代测序在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记（一般为荧光分子标记）来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。由于在二代测序中，单个DNA分子必须扩增成由相同DNA组成的基因簇，然后进行同步复制，来增强荧光信号强度从而读出DNA序列；而随着读长增长，基因簇复制的协同性降低，导致碱基测序质量下降，这严格限制了二代测序的读长（不超过500bp），因此，二代测序具有通量高、读长短的特点。二代测序适合扩增子测序（例如16S、18S、ITS的可变区），而基因组、宏基因组DNA则需要使用鸟枪法（Shotgun method）打断成小片段，测序完毕后再使用生物信息学方法进行拼接。